ГОСТ 24027.2-80
Группа Р69
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
СЫРЬЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ
Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла
Methods for determination of moisture, ash content, extractive and tannin materials, essential oil
Дата введения 1981-01-01
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 6 марта 1980 г. N 1038 срок введения установлен с 01.01.81
Ограничение срока действия снято по протоколу N 5-94 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 11-12-94)
ВЗАМЕН ГОСТ 6076-74 в части методов определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла
ПЕРЕИЗДАНИЕ.
Настоящий стандарт распространяется на лекарственное растительное сырье и устанавливает методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных, дубильных веществ и эфирного масла.
1. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛАЖНОСТИ
1.1. Метод определения влажности основан на определении потери в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ при высушивании сырья до абсолютно сухого состояния.
1.2. Отбор проб
1.2.1. Отбор проб - по ГОСТ 24027.0-80 .
1.3. Аппаратура, материалы и реактивы
шкаф сушильный лабораторный по НД;
весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 *;
______________
ГОСТ Р 53228-2008
весы аналитические по ГОСТ 24104-88 ;
разновесы по ГОСТ 7328-82 *;
______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 7328-2001 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
эксикатор по ГОСТ 25336-82 ;
совочек;
ножницы;
стаканчики для взвешивания (бюксы) с притертой крышкой по ГОСТ 25336-82 ;
щипцы тигельные;
вазелин технический;
кальций хлористый плавленый по НД.
1.4. Подготовка к испытанию
Аналитическую пробу быстро измельчают ножницами или секатором до размера частиц около 10 мм, перемешивают и берут две навески массой по 3-5 г, взвешенные с погрешностью не более 0,01 г. Каждую навеску помещают в предварительно взвешенную вместе с крышкой и пронумерованную бюксу.
При пересчете содержания золы и действующих веществ на абсолютно сухое сырье определяют потерю в массе при высушивании в пробах, подготовленных для соответствующих испытаний. При этом одновременно с навесками для определения золы и действующих веществ берут две навески сырья массой по 1-2 г, взвешенные с погрешностью не более 0,0005 г.
1.5. Проведение испытания
В сушильный шкаф, нагретый до 100-105 °С, быстро помещают подготовленные бюксы с навесками вместе со снятыми крышками. При этом температура в шкафу падает. Время, в течение которого сырье должно сушиться, отсчитывают с момента, когда температура в шкафу достигает 100-105 °С. Высушивание проводят до постоянной массы.
Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г.
При пересчете содержания золы и действующих веществ на абсолютно сухое сырье высушивание проводят до тех пор, пока разница между двумя последующими взвешиваниями не будет превышать 0,0005 г.
Первое взвешивание корней, семян, плодов и коры проводят через 3 ч, листьев, цветков и трав - через 2 ч. Бюксы с навесками вынимают из шкафа тигельными щипцами и помещают на 30 мин для охлаждения в эксикатор, на дне которого находится безводный хлористый кальций. Охлажденные бюксы закрывают крышками и взвешивают. Хлористый кальций периодически прокаливают или заменяют новым.
1.6. Обработка результатов
Влажность сырья () в процентах вычисляют по формуле
где - масса сырья до высушивания, г;
Масса сырья после высушивания, г.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, вычисленных до десятых долей процента, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,5%.
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЗОЛЫ
2.1. Метод определения содержания золы основан на определении несгораемого остатка неорганических веществ, остающегося после сжигания и прокаливания сырья. Золу делят на:
золу общую, представляющую собой сумму минеральных веществ, свойственных растению, и посторонних минеральных примесей (земля, песок, камешки, пыль);
золу, нерастворимую в 10%-ной соляной кислоте, представляющую собой остаток после обработки общей золы соляной кислотой и состоящую главным образом из кремнезема.
2.2. Отбор проб
2.2.1. Отбор проб - по ГОСТ 24027.0-80 .
2.3. Аппаратура и реактивы
Для проведения испытания применяют:
весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 ;
весы аналитические по ГОСТ 24104-88 ;
разновесы по ГОСТ 7328-82 ;
сито по ТУ 23.2.2068-89;
тигли фарфоровые по ГОСТ 9147-80 ;
кальций хлористый плавленый по НТД;
эксикатор по ГОСТ 25336-82 ;
горелку газовую или электроплитку бытовую по НТД;
печь муфельную;
баню водяную;
стекла часовые;
фильтр беззольный;
кислоту азотную по ГОСТ 4461-77 ;
аммоний азотнокислый, ч.д.а., 10%-ный раствор;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77 , х.ч., 10%-ный раствор;
перекись водорода (пергидроль) по ГОСТ 10929-76 , 5%-ный раствор;
серебро азотнокислое по ГОСТ 1277-75 , ч.д.а., 2%-ный раствор;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 ;
2.4. Подготовка к испытанию
Аналитическую пробу сырья измельчают и просеивают сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.
В предварительно прокаленный до постоянной массы фарфоровый тигель берут навеску массой 1-3 г для определения общей золы и 5 г для определения золы, нерастворимой в 10%-ной соляной кислоте. Навеску взвешивают с погрешностью не более 0,0005 г.
2.5. Проведение испытания
Сырье в тигле осторожно обугливают над слабым пламенем газовой горелки, стараясь, чтобы пламя не касалось дна тигля, или на электроплитке. При этом на нее помещают асбестовую сетку. После полного обугливания сырья тигель переносят в муфельную печь для сжигания угля и полного прокаливания остатка. Прокаливание ведут при красном калении (550-650 °С) до постоянной массы, избегая сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания, тигель охлаждают в течение 2 ч, затем ставят в эксикатор, на дне которого находится безводный хлористый кальций, охлаждают и взвешивают. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями не превышает 0,0005 г.
Если после охлаждения остаток еще содержит частицы угля, то к нему прибавляют несколько капель 5%-ного раствора перекиси водорода, концентрированной азотной кислоты или 10%-ного раствора азотнокислого аммония, выпаривают под тягой на водяной бане и вновь прокаливают до тех пор, пока остаток примет равномерную окраску. В случае необходимости такую операцию повторяют несколько раз.
Для определения содержания золы, нерастворимой в 10%-ном растворе соляной кислоты, в тигель с общей золой приливают 15 см 10%-ного раствора соляной кислоты (плотность 1,050 г/см); тигель покрывают часовым стеклом и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Затем тигель снимают и после остывания содержимое фильтруют через беззольный фильтр. Тигель, часовое стекло и фильтр промывают дистиллированной водой до прекращения появления мути в промывных водах от капли 2%-ного раствора нитрата серебра. Фильтр помещают в тигель, высушивают, осторожно сжигают в тигле после чего тигель прокаливают до постоянной массы остатка.
Проводят два параллельных определения.
2.6. Обработка результатов
Содержание общей золы () в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - масса золы, г;
Масса сырья, г;
Содержание золы, не растворимой в 10%-ном растворе соляной кислоты (), в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - масса золы, г;
- масса золы фильтра (если золы последнего более 0,002 г);
- масса сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, %.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, вычисленных до сотых долей процента для сырья с содержанием золы (общей или нерастворимой) не более 5% и до десятых долей процента - для сырья с содержанием золы (общей или нерастворимой) более 5%, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,1% для сырья с содержанием общей или нерастворимой золы 5% и 0,5% для сырья с содержанием общей или нерастворимой золы более 5%.
3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
3.1. Отбор проб
3.1.1. Отбор проб - по ГОСТ 24027.0-80 .
3.2. Аппаратура и материалы
Для проведения испытания применяют:
весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 ;
чашки фарфоровые диаметром 7-9 см по ГОСТ 9147-80 ;
баню водяную;
эксикатор по ГОСТ 25336-82 ;
колбу коническую вместимостью 250 см по ГОСТ 25336-82 ;
пипетки вместимостью 25 см по НТД;
холодильник стеклянный лабораторный по ГОСТ 25336-82 ;
сита по ТУ 23.2.2068-89;
мельницу электрическую лабораторную по НТД.
3.3. Подготовка к испытанию
Аналитическую пробу сырья измельчают и просеивают сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, после чего отбирают навеску массой 1 г.
3.4. Проведение испытания
Навеску сырья помещают в коническую колбу, приливают 50 см растворителя, указанного в нормативно-техническом документе на конкретное сырье, колбу закрывают пробкой, взвешивают с погрешностью не более 0,01 г и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают до кипения и поддерживают слабое кипение жидкости в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе дополняют тем же растворителем. Содержимое тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 150-200 см. 25 см фильтрата пипеткой переносят в фарфоровую чашку диаметром 7-9 см, предварительно высушенную при 100-105 °С до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах, выпаривают на водяной бане досуха, сушат при температуре 100-105 °С в течение 3 ч, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе, на дне которого находится безводный хлористый кальций и взвешивают.
Проводят два параллельных определения.
3.5. Обработка результатов
Содержание экстрактивных веществ () в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - масса сухого остатка в чашке, г;
- масса сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, г.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
4. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
4.1. Отбор проб
4.1.1. Отбор проб - по ГОСТ 24027.0-80 .
4.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 ;
весы аналитические по ГОСТ 24104-88 ;
разновесы по ГОСТ 7328-82 ;
сито по ТУ 23.2.2068-89 с отверстиями диаметром 3 мм;
колбы конические вместимостью 500 и 750 см по ГОСТ 25336-82 ;
баню водяную;
бюретки вместимостью 25-50 см по НТД;
пипетки вместимостью 2, 20, 25 см по НТД;
фильтры стеклянные;
склянки оранжевого стекла с притертыми пробками;
вату медицинскую по ГОСТ 5556-81 ;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 ;
индиго-5, 6-дисульфокислоты динатриевую соль (индигокармин);
калий йодистый по ГОСТ 4232-74 ;
кислоту серную по ГОСТ 4204-77 ;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77 ;
крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76 ;
калий марганцовокислый по ГОСТ 5777-84 ;
натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244-76 ;
калий двухромовокислый по ГОСТ 4220-75 , х.ч.;
натрий углекислый безводный по ГОСТ 83-79 , х.ч.;
мельницу электрическую лабораторную по НТД.
4.3. Подготовка к испытанию
Для приготовления 0,1 н. раствора марганцовокислого калия 3,3 г марганцовокислого калия растворяют в 1000 см воды и кипятят в течение 10 мин. Колбу закрывают пробкой, оставляют на двое суток в темном месте, затем фильтруют через стеклянный фильтр.
Для установки титра раствора марганцовокислого калия точно отмеривают из бюретки 25 см приготовленного раствора в склянку с притертой пробкой, содержащую 20 см раствора йодида калия. Подкисляют 2 см разведенной серной кислоты, закрывают пробкой, смоченной раствором йодида калия, и оставляют в течение 10 мин в темном месте. Разбавляют 200 см воды, обмывая пробку водой, и выделившийся йод титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия до обесцвечивания (индикатор - крахмал).
где - объем раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование, см;
- объем раствора марганцовокислого калия, взятого для установки титра (25 см);
- поправочный коэффициент раствора тиосульфата натрия.
Для приготовления разведенной серной кислоты к 5 частям воды осторожно приливают 1 часть концентрированной серной кислоты.
Для приготовления раствора йодистого калия 10 г реактива растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной воде и разбавляют такой же водой до 100 см. Раствор должен быть бесцветным. Раствор необходимо хранить в банках оранжевого стекла с притертыми пробками в защищенном от света месте.
Для приготовления 0,1 н. раствора тиосульфата натрия 26 г тиосульфата натрия и 0,1 г углекислого натрия растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной воде и доводят такой же водой до 1000 см. Раствору дают стоять 10 суток в защищенном от света месте. При наличии осадка жидкость сифонируют.
Титр раствора тиосульфата натрия устанавливают по двухромовокислому калию. Для этого около 0,15 г перекристаллизованного из горячей воды и высушенного при 130-150 °С до постоянной массы мелкорастертого двухромовокислого калия взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г и растворяют в 50 см воды в склянке с притертой пробкой. Прибавляют 2 г йодистого калия, растворенного в 10 см воды, 5 см соляной кислоты, закрывают пробкой, смоченной раствором йодистого калия, и оставляют в темном месте в течение 10 мин. Разбавляют 200 см воды, обмывая пробку водой, и титруют приготовленным раствором тиосульфата натрия до зеленовато-желтого окрашивания. Затем приливают 2-3 см раствора крахмала и продолжают титровать до перехода синей окраски в светло-зеленую.
Поправочный коэффициент () вычисляют по формуле
где 0,004904 - количество двухромовокислого калия, содержащегося в 1 см 0,1 н. раствора, г;
- навеска двухромовокислого калия, г;
- объем раствора тиосульфата, см.
Для приготовления индигосульфокислоты 1 г индигокармина растворяют в 25 см концентрированной серной кислоты, затем прибавляют еще 25 см концентрированной серной кислоты и разбавляют дистиллированной водой до 1000 см, осторожно приливая раствор в воду.
От аналитической пробы сырья, измельченного и просеянного сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, берут навеску массой 2 г с погрешностью не более 0,001 г
4.4. Проведение испытания
Сырье помещают в коническую колбу вместимостью 500 см, заливают 250 см нагретой до кипения воды и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Жидкость отстаивают, охлаждая до комнатной температуры, и декантируют около 100 см в коническую колбу вместимостью 200-250 см через вату, чтобы частицы сырья не попали в колбу. Затем отбирают пипеткой 25 см полученной жидкости в другую коническую колбу вместимостью 750 см, добавляют 500 см воды, 25 см раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,1 н. раствором калия марганцовокислого до золотисто-желтого окрашивания, сравнивая его с окраской раствора контрольного испытания.
Для проведения контрольного испытания в коническую колбу вместимостью 750 см, наливают 525 см дистиллированной воды, добавляют 25 см раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,1 н. раствором марганцовокислого калия до золотисто-желтого окрашив
4.5. Обработка результатов
Содержание дубильных веществ () в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - объем точно 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, израсходованного на титрование извлечения, см;
- объем точно 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, израсходованного на титрование в контрольном анализе, см;
0,004157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 см точно 0,1 н. раствора марганцовокислого калия (в пересчете на танин), г;
- масса сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, %;
250 - вместимость мерной колбы, см;
25 - объем жидкого извлечения, взятого для титрования, см.
5. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭФИРНОГО МАСЛА
5.1. Сущность метода заключается в перегонке из растительного сырья с водяным паром эфирного масла и последующем измерении его объема, выраженного в процентах по отношению к абсолютно сухому сырью.
Определение проводят методом 1, 2а или 2б. Метод 2б используют в тех случаях, когда сырье содержит эфирные масла, которые при перегонке претерпевают изменения, образуют эмульсию, легко загустевают или имеют плотность, близкую к единице или больше единицы.
Масса навески сырья взятого для анализа, степень его измельчения, время перегонки - по нормативно-техническому документу на конкретное растительное сырье.
5.2. Отбор проб
5.2.1. Отбор проб - по ГОСТ 24027.0-80 .
5.3. Определение содержания эфирного масла методом 1 (Гинзбурга)
5.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Для проведения испытания применяют:
весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 ;
мельницу электрическую лабораторную по НТД;
колбу широкогорлую круглодонную вместимостью 1000 см по ГОСТ 25336-82 ;
колбу плоскодонную вместимостью 1000 см по
пробку резиновую;
ножницы;
ацетон по ГОСТ 2603-79 , ч.д.а.
5.3.2. Проведение испытания
Навеску измельченного сырья помещают в широкогорлую круглодонную или плоскодонную колбу, наливают 300 см воды и закрывают резиновой пробкой с обратным шариковым холодильником. В пробке снизу укрепляют металлические крючки, на которые при помощи тонкой проволоки подвешивают градуированный приемник так, чтобы конец холодильника находился точно под воронкообразным расширением приемника на расстоянии около 1 мм, не касаясь его. Приемник должен свободно помещаться в горле колбы, не прикасаясь к стенкам горла, и отстоять от уровня воды не менее чем на 50 мм (черт.1). Колбу с содержимым нагревают до кипения и поддерживают его в течение времени, указанного в нормативно-техническом документе на конкретное сырье.
Черт.1. - Прибор для определения содержания эфирного масла методом 1
Прибор для определения содержания эфирного масла методом 1 (Гинзбурга)
1 - колба; 2 - резиновая пробка; 3 - холодильник; 4 - градуированный приемник
Пары воды и эфирного масла конденсируются в холодильнике и жидкость стекает в приемник. Масло отстаивается в градуированном колене приемника, а вода через меньшее колено приемника вытекает обратно в колбу.
Объем масла в градуированной части приемника определяют после окончания перегонки и охлаждения колбы до комнатной температуры. Прибор после шести-восьми определений промывают ацетоном, затем водой.
5.3.3. Обработка результатов
- масса сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, %.
5.4. Определение содержания эфирного масла методом 2а (Клевенджера)
;
электромельницу;
мельницу электрическую лабораторную по НД.
Черт.2. - Прибор для определения содержания эфирного масла методами 2а и 2б
Прибор для определения содержания эфирного масла методами 2а и 2б (Клевенджера)
1 - колба; 2 - паропроводная изогнутая трубка; 3 - холодильник; 4 - градуированный приемник; 5 - спускной кран; 6 - расширение приемника; 7 - боковая трубка приемника; 8 - резиновый шланг; 9 - сливная трубка
5.4.2. Подготовка к испытанию
Перед каждым определением прибор очищают, пропуская пар в течение 15-20 мин.
5.4.3. Проведение испытания
Навеску измельченного растительного сырья помещают в колбу, приливают 300 см воды, колбу соединяют через шлиф с паропроводящей трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резинового шланга, оканчивающегося воронкой. Содержимое колбы нагревают до кипения и кипятят с интенсивностью, при которой скорость стекания дистиллята должна быть 60-65 капель в минуту в течение времени, указанного в нормативно-техническом документе на конкретное сырье. Через 5 мин после окончания перегонки замеряют объем эфирного масла в градуированной части приемника. Для этого открывают кран и спускают часть дистиллята до уровня градуированной трубки.
5.4.4. Обработка результатов
Содержание эфирного масла () в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - объем эфирного масла, см;
- масса сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, %.
5.5. Определение содержания эфирного масла методом 2б
5.5.1. Аппаратура и реактивы
Для проведения испытания применяют аппаратуру, указанную в п.5.4.1, и декалин.
5.5.2. Проведение испытания
Навеску измельченного растительного сырья помещают в колбу, приливают 300 см воды, колбу соединяют через шлиф с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резинового шланга, оканчивающегося воронкой. Затем через воздушную трубку при помощи пипетки приливают в приемник около 0,5 мл декалина и точно измеряют объем взятого декалина, опуская уровень жидкости в градуированную часть трубки. Далее испытание проводят по п.5.4.3.
Проводят два параллельных определения.
5.5.3. Обработка результатов
Содержание эфирного масла () в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
где - объем раствора масла в декалине, см;
- объем декалина, см;
- масса навески сырья, г;
- потеря в массе при высушивании сырья, %.
За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, вычисленное до сотых долей процента.
Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
Лекарственное растительное сырье. Часть 2.
Корни, плоды, сырье: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 1999
Для получения суммы дубильных веществ растительное сырье экстрагируют горячей водой в соотношении 1:30 или 1:10.
Качественные реакции на дубильные вещества можно подразделить
на 2 группы:
Ø Общие реакции осаждения – для обнаружения дубильных веществ
Ø Групповые – для установления принадлежности дубильных веществ к определенной группе
Для обнаружения дубильных веществ в растительном сырье используют следующие реакции:
1. Специфической реакцией на дубильные вещества является реакция осаждения желатином. Используют 1 %-й раствор желатина на 10 %-ном растворе хлорида натрия. Появляется хлопьевидный осадок, растворимый в избытке желатина. Отрицательная реакция с желатином свидетельствует об отсутствии дубильных веществ.
2. Реакция с солями алкалоидов. Образуется аморфный осадок за счет образования водородных связей с гидроксильными группами дубильных веществ и атомами азота алкалоида.
Эти реакции дают одинаковый результат независимо от группы дубильных веществ.
Реакции, позволяющие определить группу дубильных веществ.
1.Реакция Стиасни – с 40 % раствором формальдегида и конц. HCl -
Конденсированные дубильные вещества образуют осадок кирпично-красного цвета
2.Бромная вода (5 г брома в 1 л воды) - к 2-3 мл испытуемого раствора прибавляют по каплям бромную воду до появления в растворе запаха брома; в случае присутствия конденсированных дубильных веществ образуется оранжевый или желтый осадок.
3. Окрашивание с солями трехвалентного железа, железоаммонийными квасцами –
черно-синее (дубильные вещества гидролизуемой группы, которые являются производными пирогаллола)
или черно-зеленое (дубильные вещества конденсированной группы, которые являются производными пирокатехина).
4.Катехины дают красное окрашивание с ванилином
(в присутствии конц. HCl или 70 %-ной H 2 SO 4 развивается яркая красная окраска).
Катехины образуют при этой реакции окрашенный продукт следующего строения:
Реакцией отличающей пирогалловые танниды от пирокатехиновых является реакция нитрозометилуретаном.
При кипячении растворов дубильных веществ с нитрозометилуретаном танниды пирокатехинового ряда осаждаются полностью,
а присутствие пирогалловых таннидов можно обнаружить в фильтрате путем прибавления железоаммиачных квасцов и натрия ацетата – фильтрат окрашивается в фиолетовый цвет.
Свободная эллаговая кислота дает красно-фиолетовую окраску при добавлении нескольких кристаллов нитрита натрия и трех-четырех капель уксусной кислоты.
7. Для обнаружения связанной эллаговой кислоты (или гаксаоксидифеновой) уксусную кислоту заменяют 0,1 н. серной или соляной кислотой (кармино-красная окраска, переходящая в синюю).
8. Дубильные вещества с белками создают непроницаемую для воды пленку (дубление). Вызывая частичное свертывание белков, они образуют на слизистых оболочках и раневых поверхностях защитную пленку.
9. При соприкосновении с воздухом (например, резке свежих корневищ) дубильные вещества легко окисляются, превращаясь во флобафены или красени, которые обусловливают темно-бурую окраску многих кор и других органов, настоев.
Флобафены нерастворимы в холодной воде, растворяются в горячей воде, окрашивая отвары и настой в бурый цвет.
10. С 10 %-ным раствором среднего ацетата свинца (одновременно добавляют 10 %-ный раствор уксусной кислоты) :
образуется белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества гидролизуемой группы (осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание конденсированных дубильных веществ, с 1 %-ным раствором железоаммонийных квасцов – черно-зеленое окрашивание);
белый осадок, растворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества конденсированной группы.
Дубильные вещества - сложные высокомолекулярные природные растительные фенольные соединения, способные осаждать белки и алкалоиды и дубить невыделанную шкуру животных, превращая ее в прочный, неподдающийся гниению продукт - кожу.
Термин «дубильные вещества» был введен французским ученым П. Сегеном в 1796 г.
Таннины, или танниды, - синоним термина «дубильные вещества». Он происходит от латино-кельтского обозначения дуба - «тан» - и широко распространен в научной литературе.
Способность этих веществ «дубить» белки шкур животных, делать их непроницаемыми для воды и устойчивыми к микробному гниению основана на их свойстве взаимодействовать с коллагеном, приводящим к образованию стойких полимерных структур. Дубление - сложный физико-химический процесс, связанный с возникновением водородных, ковалентных и электровалентных связей между молекулами коллагена и фенольными группами дубильных веществ.
Дубящими свойствами обладают только многоядерные фенолы, содержащие более одной ОН-группы. Это крупные фенольные молекулы с молекулярной массой от 300 до 500 и иногда до 20 000. Фенолы одноядерные и не содержащие многочисленных ОН-групп лишь адсорбируются на белках, но не могут образовать перекрестные связи между собой и белковыми группами, «сшивать» мономерные белковые группы. Они в той или иной степени инактивируют ферментные белки, но не вызывают фенол-белковых сцепок в коллагене - основном белковом компоненте шкур. Поэтому низкомолекулярные фенолы имеют лишь вяжущий вкус, их еще называют пищевыми (чайными) таннинами.
Классификация
Первая попытка классификации дубильных веществ была предпринята шведским химиком И. Берцелиусом, который разделил эти вещества на две группы по их способности давать с солями Fe (III) черные соединения зеленоватого или синеватого оттенка. Впоследствии эта простая классификация дубильных веществ легла в основу более точной научной классификации, предложенной К. Фрейденбер-
гом. Он стал делить дубильные вещества в зависимости от их способности гидролизоваться под действием кислот (или ферментов) на две группы:
1) гидролизуемые дубильные вещества:
Галлотаннины;
Эллаготаннины;
Депсиды, или несахарные эфиры карбоновых кислот;
2) негидролизуемые (конденсированные) дубильные вещества, или флоба- фены, которые подразделяют на производные:
Катехинов (флаван-3-олов);
Лейкоантоцианидинов (флаван-3,4-диолов);
Гидростильбенов.
Гидролизуемые дубильные вещества. Галлотаннины - сложные эфиры гексоз (обычно D-глюкозы) и галловой кислоты. В глюкозе имеется пять ОН-групп, благодаря которым могут образовываться моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и полигаллоильные эфиры. Представителем группы полигаллоильных эфиров является китайский таннин, который получают из листьев и образующихся на них наростов (галлов) сумаха полукрылатого (Rhus semialata Murr.). Представителем многогаллоильных эфиров является P-D-глюкогаллин, выделенный из корня ревеня и листьев эвкалипта.
Эллаготаннины - эфиры D-глюкозы и гексадифеноловой, хебуловой и других кислот, образующихся вместе c эллаговой кислотой. Эллаготаннины найдены в коре плодов граната, кожуре грецкого ореха, коре дуба, соплодиях ольхи. В растениях присутствует обычно не эллаговая, а гексагидроксидифеновая кислота.
При кислотном гидролизе дубильных веществ эта кислота превращается в дилак- тон - эллаговую кислоту.
Депсиды представляют собой эфиры галловой кислоты с хинной, хлорогено- вой, кофейной, гидроксикоричной кислотами, атакже флаванами. Эфиры галловой кислоты и катехинов находятся в листьях чая. Из листьев зеленого чая выделен теогаллин.
Теогаллин (депсид)
Преимущественно гидролизуемые дубильные вещества содержат такие ЛР, как скумпия кожевенная, сумах дубильный, горец змеиный, бадан толстолистный, кровохлебка лекарственная, ольха черная и о. серая.
Преимущественно конденсированные дубильные вещества содержат дуб обыкновенный, лапчатка прямостоячая, черника обыкновенная, черемуха обыкновенная.
Негидролизуемые дубильные вещества. Представляют собой олигомеры и полимеры катехинов, лейкоантоцианидинов и гидроксистильбенов, где звенья связаны друг с другом прочными углерод-углеродными связями в положениях С2-С6, С2-С8, С4-С8, С5-С2. Кроме того, они никогда не содержат остатков сахара.
При образовании конденсированных дубильных веществ разрывается пира- новое кольцо катехина (лейкоантоцианидина) и С2-атом соединяется С-С-свя- зью с С6-атомом другой молекулы катехина (лейкоантоцианидина). Конденсированные дубильные вещества не распадаются под действием кислот; наоборот, они имеют тенденцию из олигомеров превращаться в более длинные полимеры (полимеризация в кислоте) с образованием аморфных, часто окрашенных в красный цвет соединений - флобафенов. Образование конденсированных дубильных веществ происходит в живом растении в процессе биосинтеза и после его смерти - при технологической обработке древесины.
 |
Образование конденсированных дубильных веществ из мономеров
По физико-химическим свойствам дубильные вещества представляют собой аморфные соединения желтоватого или бурого цвета.
Природные дубильные вещества имеют среднюю молекулярную массу 500-5000, но отдельные соединения - до 20 000. При нагревании до 180-200 °С дубильные вещества (не плавясь) обугливаются, выделяя пирогаллол или пирокатехин. Растворяются во многих органических растворителях (ацетон, этанол, этилацетат, пиридин), но не в хлороформе, петролейном эфире, бензоле. Также хорошо растворимы в воде, лучше горячей. При растворении в воде дают коллоидные растворы слабокислой реакции. С солями тяжелых металлов образуют окрашенные комплексы. Осаждаются растворами аминокислот, белков, алкалоидов. Многие дубильные вещества - оптически активные соединения. Обладают вяжущим вкусом. Легко окисляются на воздухе, приобретая красно-бурую окраску, иногда темно-коричневую. Присутствие гидроксидов щелочных металлов сильно ускоряет процесс окисления дубильных веществ. Гидролизуемые дубильные вещества под действием кислот или ферментов распадаются на органические кислоты и глюкозу.
Выделение из ЛРС
Дубильные вещества - это смесь различных полифенолов, имеющих сложную структуру, очень лабильных, поэтому выделение и анализ отдельных компонентов дубильных веществ представляет большие трудности. Для получения суммы дубильных веществ ЛРС экстрагируют горячей водой, охлаждают, а затем экстракт обрабатывают последовательно:
1) петролейным эфиром или бензолом (для очистки от хлорофилла, терпе- ноидов, липидов);
2) диэтиловым эфиром, который извлекает катехины, оксикоричные кислоты и другие фенольные соединения;
3) этилацетатом, в который переходят лейкоантоцианидины, эфиры оксико- ричной кислоты и др.
Оставшееся водное извлечение с дубильными веществами и другими фенольными соединениями и фракциями 2 и 3 (диэтилового эфира и этилацетата) разделяют на индивидуальные компоненты с помощью различных видов хроматографии. Используют:
Адсорбционную хроматографию на колонках целлюлозы, полиамида (иногда вместо полиамида используют гольевый порошок);
Распределительную хроматографию на колонках силикагеля;
Ионообменную хроматографию;
Гель-фильтрацию на колонках сефадекса и др.
Идентификация индивидуальных дубильных веществ основана на сравнении Rf в хроматографических методах (на бумаге, в тонком слое сорбента), спектральных исследованиях, качественных реакциях и изучении продуктов расщепления (для гидролизуемых дубильных веществ).
Качественное выделение дубильных веществ
Качественные реакции определения дубильных веществ можно разделить на две группы:
1) общие (осаждения) - для обнаружения присутствия дубильных веществ;
2) групповые (цветные) - для установления принадлежности дубильных веществ к определенной группе.
Прежде всего для проведения качественных реакций готовят водное извлечение дубильных веществ из ЛРС.
Дубильные вещества обнаруживают, используя следующие реакции:
Соединяя с 1 % раствором желатина в 10 % растворе NaCl. Появляется муть, исчезающая при добавлении избытка желатина. Реакция специфична;
Осаждая солями алкалоидов (например, сульфатом хинина). Образуется белый осадок;
Соединяя с 5 % раствором дихромата калия (К2Сг2О7). Образуется коричневый осадок или муть. Эта же реакция используется и как гистохимическая для обнаружения локализации дубильных веществ в ЛРС;
Соединяя с раствором основного ацетата свинца: образуется белый осадок;
Соединяя с ванилином (в присутствии 70 % серной или концентрированной хлористо-водородной кислоты) дубильные вещества, содержащие мономеры катехинового типа, развивают красное окрашивание.
Классификацию дубильных веществ проводят с помощью следующих реакций:
С 1 % раствором железоаммонийных квасцов (или другими источниками ионов Fe3+): гидролизуемые дубильные вещества дают черно-синее окрашивание, а конденсированные - черно-зеленое;
С 10 % раствором среднего ацетата свинца в 10 % уксусной кислоте: гидролизуемые дубильные вещества выпадают в белый хлопьевидный осадок, а конденсированные остаются в растворе и их можно также затем определить (например, по зеленовато-черному окрашиванию с Fe3+);
Со смесью из 40 % раствора формальдегида и концентрированной HCl: конденсированные дубильные вещества выпадают в осадок, а гидролизуемые остаются в водном растворе (что можно установить по синевато-черному окрашиванию в дополнительном тесте с Fe3+);
С кристалликами NaNO2 и раствором 0,1 М HCl: при наличии в экстракте ЛРС дубильных веществ появляется коричневое окрашивание;
С раствором HCl и добавлении 1 % раствора (или кристалликов) ванилина гидролизуемые дубильные вещества, состоящие из мономеров катехинов, при нагревании дают ярко-красное окрашивание. Гидролизуемые дубильные вещества, состоящие из мономеров лейкоантоцианидинов, можно обнаружить, нагревая извлечение с раствором HCl: появляется красное окрашивание (за счет образования анто- цианидинов, дающих красное окрашивание в кислых значениях рН);
При добавлении бромной воды и нагревании конденсированные дубильные вещества в экстракте из ЛРС выпадают в осадок.
При хроматографическом определении дубильных веществ этанольный экстракт из ЛРС наносят на стартовую линию хроматографической пластинки «Си- луфол», помещают в хроматографическую камеру (с соответствующими растворителями, указанными в НД), а после проведения разделения пластинку просматривают в УФ-свете и отмечают, что некоторые производные катехинов имеют голубую флуоресценцию, которая усиливается при обработке хроматограмм 1 % раствором ванилина в концентрированной HCl. После выдерживания хроматограмм в парах HCl с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 105 °С в течение 2 мин дубильные вещества лейкоантоцианидинового типа переходят в антоцианидины розового или красно-фиолетового цвета.
Количественное определение дубильных веществ
Методы количественного определения дубильных веществ в ЛРС можно разделить на гравиметрические, титриметрические и физико-химические.
Гравиметрические методы основаны на количественном осаждении дубильных веществ солями тяжелых металлов, желатиной или адсорбцией гольевым порошком. Методы осаждения дубильных веществ ацетатом меди или желатиной потеряли свое значение.
Однако весовой единый метод (ВЕМ) применяется в кожевенной промышленности. Метод основан на способности дубильных веществ давать прочные соединения с коллагеном кожи. Для этого полученное водное извлечение из ЛРС делят на две равные части. Одну часть выпаривают, высушивают и взвешивают; вторую обрабатывают гольевым (кожным) порошком, фильтруют. Фильтрат выпаривают, высушивают и взвешивают. По разности сухих остатков 1-й и 2-й частей (т. е. контроля и опыта) определяют содержание дубильных веществ в растворе.
Титриметрическийметод, включенный в ГФ РБ (вып. 2, с. 348), именуемый методом Левенталя - Нейбауэра, основан на окислении фенольных ОН-групп перманганатом калия ^MnO4) в присутствии индигосульфокислоты, являющейся регулятором и индикатором реакции. После полного окисления дубильных веществ начинает окисляться индигосульфокислота до изатина, в результате чего окраска раствора из синей переходит в золотисто-желтую.
Другой титриметрический метод определения дубильных веществ - метод осаждения таннина сульфатом цинка с последующим комплексонометрическим титрованием трилоном Б в присутствии ксиленового оранжевого (используется, в частности, для определения таннина в листьях сумаха дубильного и скумпии кожевенной).
Физико-химические методы определения дубильных веществ:
Колориметрические - связаны со способностью дубильных веществ давать окрашенные соединения с фосфорно-молибденовой или фосфорно-вольфрамовой кислотами в присутствии Na2CO3 или с реактивом Фолина - Дениса (на фенолы). ГФ РБ (т. 1; 2.8.14) предлагает фотоколометрическое определение экстрагированных из ЛРС в водный раствор дубильных веществ с раствором фосфорно-молибденового реагента в присутствии натрия карбоната при длине волны 760 нм;
Хромато-спектрофотометрические и нефелометрические методы, которые используют главным образом в научных исследованиях.
Распространение в растительном мире, условия образования и роль в растениях
Дубильные вещества широко распространены в растительном мире. Они встречаются в грибах, водорослях, папоротниках, хвощах, мхах, плаунах, у высших растений (покрыто- и голосеменных). Многие хвойные накапливают достаточно большое количество дубильных веществ. Максимальное их накопление обнаружено у отдельных представителей двудольных растений, тогда как у однодольных оно отмечено лишь у некоторых семейств. Низкое содержание дубильных веществ у злаков. У двудольных некоторые семейства (например, Розоцветные, Гречишные, Бобовые, Ивовые, Сумаховые, Буковые, Вересковые) насчитывают многие роды и виды, где содержание таннидов доходит до 20-30 % и более. Наивысшее содержание дубильных веществ выявлено в патологических образованиях - галлах (до 60-80 %). Древесные формы богаче дубильными веществами, чем травянистые. Дубильные вещества неравномерно распределены по органам и тканям растений. Они накапливаются главным образом в коре и древесине деревьев и кустарников, а также в подземных частях травянистых многолетников; зеленые части растений значительно беднее дубильными веществами. В частности, дубильные вещества накапливаются:
В подземных органах (лапчатка прямостоячая, кровохлебка лекарственная, бадан толстолистный);
Коре (дуб обыкновенный);
Траве (виды зверобоя);
Плодах (черника обыкновенная, черемуха обыкновенная, ольха клейкая и
о. серая);
Листьях (сумах дубильный, скумпия кожевенная).
Дубильные вещества аккумулируются в вакуолях, а при старении клеток адсорбируются на клеточных стенках. Чаще всего в растениях встречается смесь гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ с преобладанием соединений той или иной группы.
Содержание дубильных веществ в растениях изменяется в зависимости от периода вегетации и возраста растений. Их накопление одновременно сопровождается резким увеличением массы корневых систем. С возрастом растений количество дубильных веществ в них уменьшается. Период вегетации влияет не только на количественный, но и на качественный состав дубильных веществ.
Растущие на солнце растения накапливают больше дубильных веществ, чем растущие в тени (так, в тропических растениях их образуется значительно больше, чем в растениях умеренных широт). На содержание дубильных веществ в растениях влияет также высота над уровнем моря, время года - особенно в областях с резко выраженной сезонностью климата. Содержание дубильных веществ зависит как от климатических, почвенных, так и от генетических (наследственных) факторов растения.
Установлено, что большинство дубильных веществ в листьях находится в клетках паренхимы, окружающих жилку, т. е. дубильные вещества образуются в листьях и оттуда проходят в клетки флоэмы проводящих пучков, по которым разносятся по всему растению. Обладая бактерицидными свойствами (благодаря своей фенольной природе), они препятствуют гниению древесины и являются веществами, защищающими растения от вредителей и возбудителей заболеваний. Дубильные вещества также участвуют в процессах метаболизма растений. Они откладываются как запасные продукты, которые могут использоваться затем при весеннем пробуждении и нарастании вегетативных органов.
Биомедицинское действие и применение
Дубильные вещества и содержащие их ЛР применяют в основном в качестве вяжущих, противовоспалительных и кровоостанавливающих средств.
Растворы таннидов связываются с белками кожи, образуя непроницаемую для воды пленку. На этом основано их медицинское применение в виде вяжущих средств, так как образующаяся на слизистых оболочках пленка препятствует дальнейшему воспалению, а нанесенные на рану, они свертывают кровь и поэтому действуют как местные кровоостанавливающие средства. Свойство образования пленки на языке обусловливает характерный вяжущий вкус дубильных веществ.
Как вяжущие средства;
Кровоостанавливающие средства;
Противовоспалительные средства;
Антимикробные средства;
а также в качестве:
P-витаминных и антисклеротических средств (гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества);
Антиоксидантов и гипооксантов (конденсированные дубильные вещества);
Противоопухолевых средств (конденсированные дубильные вещества);
Противоядия при отравлении гликозидами, алкалоидами и солями тяжелых металлов (дубильные вещества).
Показано, что большие дозы дубильных веществ оказывают противоопухолевое действие, средние - радиосенсибилизирующее, малые - противолучевое.
Широкое применение дубильные вещества находят также в кожевенной, коньячной и пищевой промышленности.
Заготовка ЛРС, содержащего дубильные вещества
Заготовку проводят в период максимального содержания дубильных веществ. Сушат быстро при температуре 50-60 °С, так как продолжительное хранение свежего сырья ведет к гидролитическому расщеплению гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ под влиянием ферментов. Высушенное ЛРС хранят цельным в сухом помещении в упакованном виде. При хранении измельченного ЛРС повышается скорость окисления дубильных веществ, изменяется цвет.
Дубильными веществами (танидами) называют растительные высокомолекулярные фенольные соединения, способные осаждать белки и обладающие вяжущим вкусом.
Термин “дубильные вещества” сложился исторически, благодаря способности этих соединений превращать сырую шкуру животных в прочную кожу, устойчивую к воздействию влаги и микроорганизмов. Использовать этот термин официально предложил в 1796 г Сеген для обозначения в экстрактах некоторых растений веществ, способных осуществлять процесс дубления.
Дубление - это сложное химическое взаимодействие танидов с молекулами коллагена - основного белка соединительной ткани. Дубящими свойствами обладают многоядерные фенолы, содержащие в молекуле более одного гидроксила. При плоском расположении танида на белковой молекуле между ними возникают устойчивые водородные связи:
Фрагмент молекулы белка Фрагмент молекулы танида
Прочность взаимодействия танида с белком зависит от числа водородных связей и лимитируется величиной молекулы полифенольного соединения. Молекулярная масса дубильных веществ может составлять до 20 000. При этом на 100 единиц молекулярной массы в танидах приходится по 1-2 фенольные оксигруппы. Поэтому количество образующихся водородных связей многочисленно и процесс дубления является необратимым. Гидрофобные радикалы, ориентированные во внешнюю среду, делают кожу недоступной для влаги и микроорганизмов.
Не все дубильные вещества способны к истинному дублению. Этим свойством отличаются соединения, имеющие молекулярную массу 1 000 и более. Полифенольные соединения с массой менее 1 000 не способны дубить кожу и обладают только вяжущим действием.
Дубильные вещества очень широко применяются в промышленности. Достаточно сказать, что мировое производство танидов превышает 1 500 000 тонн в год, а доля растительных танидов составляет до 50-60% от общего количества.
Распространение в растительном мире и роль дубильных веществ в растениях. Дубильные вещества широко встречаются у представителей покрыто- и голосемянных, водорослей, грибов, лишайников, в плаунах и папоротниках. Они содержатся во многих высших растениях, особенно двудольных. Наибольшее их количество выявлено в ряде представителей семейств Fabaceae, Myrtaceae, Rosaceae, Anacardiaceae, Fagaceae, Polygonaceae.
Дубильные вещества в растении находятся в клеточных вакуолях и при старении клеток адсорбируются на клеточных стенках. В больших количествах накапливаются в подземных органах, коре, но могут быть в листьях и плодах.
Дубильные вещества выполняют в растениях в основном защитные функции. При механическом повреждении тканей начинается усиленное образование дубильных веществ, сопровождающееся их окислительной конденсацией в поверхностных слоях, защищая тем самым растение от дальнейшего повреждения и негативного влияния болезнетворных микроорганизмов. Благодаря большому количеству фенольных гидроксилов дубильные вещества обладают выраженными бактериостатическими и фунгицидными свойствами, предохраняя тем самым растительные организмы от различных заболеваний.
Классификация дубильных веществ. В 1894 г. Г. Проктер, изучая конечные продукты пиролиза дубильных веществ, обнаружил 2 группы соединений - пирогалловые (образуется пирогаллол) и пирокатехиновые (при разложении образуется пирокатехин):
К. Фрейденберг в 1933 г. уточнил классификацию Г. Проктера. Он, как и Проктер, классифицировал дубильные вещества по конечным продуктам их распада, но не в условиях пиролиза, а при кислотном гидролизе. В зависимости от способности к гидролизу К. Фрейденберг предложил выделить две группы дубильных веществ:гидролизуемые и конденсированные. В настоящее время более часто пользуются класификацией К. Фрейденберга.
К группе гидролизуемых дубильных веществ относятся соединения, построенные по типу сложных эфиров и распадающиеся при кислотном гидролизе на составляющие компоненты. Центральным звеном чаще всего бывает глюкоза, реже - другие сахара или алициклические соединения (например, хинная кислота). Спиртовые гидроксилы центрального остатка могут быть связаны эфирной связью с галловой кислотой, образуя при этом группу галлотанинов , или эллаговой кислотой, образуя группу эллаготанинов .
Галлотанины - эфиры галловой кислоты, наиболее часто встречаемые в группе гидролизуемых дубильных веществ. Существуют моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и полигаллоильные эфиры. Представителем моногаллоильных эфиров является b-D-глюкогаллин:
Примером полигаллоильных эфиров может служить китайский танин, структура которого впервые была установлена в 1963 г. Хэуорсом:
Эллаготанины являются сложными эфирами сахара и эллаговой кислоты или ее производными. Эллаговая кислота образуется при окислении двух молекул галловой кислоты до гексаоксидифеновой, которая тотчас же образует лактон – эллаговую кислоту:
Как и в предыдущем случае, сахарным компонентом эллаготанинов чаще всего выступает глюкоза.
Несахарные эфиры галловых кислот представляют собой сложные эфиры галловой кислоты и несахарного компонента, такого как хинная кислота, оксикоричная и др. Примером данной группы веществ может служить 3,4,5-тригаллоилхинная кислота.
Конденсированные дубильные вещества отличаются от гидролизуемых тем, что при кислотном гидролизе не происходит их расщепления на составляющие компоненты, а наоборот, под действием минеральных кислот образуются плотные красно-коричневые продукты полимеризации - флобафены.
Конденсированные дубильные вещества образованы главным образом катехинами и лейкоцианидинами, и, гораздо реже, другими восстановленными формами флавоноидов. Конденсированные дубильные вещества не относятся к группе «Гликозиды»: в конденсированных дубильных веществах сахарный компонент отсутствует.
Образование конденсированных дубильных веществ может происходить двумя путями. К. Фрейденберг (30-е годы XX в) установил, что образование конденсированных дубильных веществ - это неферментативный процесс аутоконденсации катехинов или лейкоцианидинов (или их перекрестная конденсация) в результате воздействия кислорода воздуха, тепла и кислой среды. Аутоконденсация сопровождается разрывом пиранового кольца катехинов и С-2 углеродный атом одной молекулы соединяется углерод-углеродной связью с С-6 или С-8 углеродным атомом другой молекулы. При этом может образовываться достаточно протяженная цепь:
По мнению другого ученого - Д. Хатуэя, конденсированные дубильные вещества могут образовываться в результате ферментативной окислительной конденсации молекул по типу “голова к хвосту” (кольцо А к кольцу В) или “хвост к хвосту” (кольцо В к кольцу В):
В растениях, содержащих конденсированные дубильные вещества, обязательно есть их предшественники - свободные катехины или лейкоцианидины. Часто встречаются смешанные конденсированные полимеры, состоящие из катехинов и лейкоцианидинов.
Как правило, в растениях одновременно присутствуют дубильные вещества как конденсированной, так и гидролизуемой групп.
Физико-химические свойства дубильных веществ . Дубильные вещества отличаются высокой молекулярной массой - до 20 000. Природные дубильные вещества, за небольшим исключением, известны до настоящего времени только в аморфном состоянии. Причина этого заключается в том, что эти вещества представляют собой смеси соединений, сходные по химической структуре, но различающиеся по молекулярной массе.
Дубильные вещества - это желтые или бурые соединения, образующие в воде коллоидные растворы. Растворимы в этаноле, ацетоне, бутаноле и не растворимы в растворителях с выраженной гидрофобностью - хлороформе, бензоле и т.п.
Галлотанины плохо растворимы в холодной воде и относительно хорошо - в горячей.
Дубильные вещества обладают оптической активностью, легко окисляются на воздухе.
Благодаря наличию фенольных гидроксилов осаждаются солями тяжелых металлов и образуют окрашенные соединения с Fe +3 .
Выделение дубильных веществ из растительного сырья. Поскольку дубильные вещества представляют собой смесь различных полифенолов, их выделение и анализ представляет определенную трудность.
Часто для получения суммы дубильных веществ сырье экстрагируют горячей водой (дубильные вещества плохо растворимы в холодной воде) и охлажденную вытяжку обрабатывают органическим растворителем (хлороформ, бензол и др.) для удаления липофильных веществ. Затем дубильные вещества осаждают солями тяжелых металлов с последующим разрушением комплекса серной кислотой или сульфидами.
Для получения фракции дубильных веществ, сходных по химической структуре, можно использовать экстракцию сырья диэтиловым эфиром, метиловым или этиловым спиртами с предварительным удалением липофильных компонентов с помощью растворителей с выраженной гидрофобностью – петролейным эфиром, бензолом, хлороформом.
Широко распространено выделение некоторых компонентов дубильных веществ осаждением из водных или водно-спиртовых растворов солями свинца. Полученные осадки затем обрабатывают разбавленной серной кислотой.
При выделении индивидуальных компонентов дубильных веществ используют хроматографические методы: адсорбционную хроматографию на целлюлозе, полиамиде; ионообменную на различных катионитах; распределительную на силикагеле; гельфильтрацию на молекулярных ситах.
Идентификацию индивидуальных компонентов дубильных веществ проводят с помощью хроматографии на бумаге или в тонком слое сорбента, с помощью спектрального анализа, качественных реакций и изучения продуктов расщепления.
Качественный анализ дубильных веществ . Качественные реакции на дубильные вещества можно разделить на две группы: реакции осаждения и цветные реакции. Для проведения качественных реакций сырье, чаще всего, экстрагируют горячей водой.
Реакции осаждения. 1. При взаимодействии дубильных веществ с 1% раствором желатина, приготовленном на 10% растворе натрия хлорида, образуется осадок или возникает помутнение раствора. При добавлении избытка желатина помутнение исчезает.
2. Таниды дают обильные осадки с алкалоидами (кофеин, пахикарпин), а также некоторыми азотистыми основаниями (уротропин, новокаин, дибазол).
3. При взаимодействии с 10% раствором уксуснокислого свинца дубильные вещества гидролизуемой группы образуют хлопьевидный осадок.
4. Дубильные вещества конденсированной группы образуют хлопьевидный осадок в реакции с бромной водой.
Цветные реакции. Дубильные вещества гидролизуемой группы с раствором железоаммонийных квасцов образуют черно-синие окрашенные соединения, а конденсированной группы - черно-зеленые.
Если в растении одновременно содержатся дубильные вещества и гидролизуемой и конденсированной группы, то вначале гидролизуемые таниды осаждают 10% раствором ацетата свинца, осадок отфильтровывают, а затем проводят реакцию фильтрата с раствором железоаммонийных квасцов. Появление темно-зеленой окраски свидетельствует о наличии веществ конденсированной группы.
Количественное определение дубильных веществ. При том, что существует около 100 различных способов количественного определения дубильных веществ, точный количественный анализ этой группы биологически активных веществ затруднен.
Среди широко применяемых способ количественного определения дубильных веществ можно выделить следующие.
1. Гравиметрические - основаны на количественном осаждении дубильных веществ желатином, солями тяжелых металлов и т.п.
2. Титриметрические - основаны на окислительных реакциях, прежде всего с перманганатом калия.
3. Фотоэлектроколориметрические - основаны на способности дубильных веществ образовывать устойчивые окрашенные продукты реакции с солями окисного железа, фосфорновольфрамовой кислотой и т.д.
Государственной Фармакопеей X и XI изданий рекомендован титриметрический способ количественного определения дубильных веществ.
Содержимое (Table of Contents)
ОФС.1.5.3.0008.15 Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах
Взамен ст. ГФ XI
Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят титриметрическим и/или спектрофотометрическим методами. Титриметрический метод заключается в определении суммы дубильных веществ в пересчете на танин, а спектрофотометрический метод позволяет определять сумму дубильных веществ в пересчете на пирогаллол.
Метод 1. Определение суммы дубильных веществ в пересчете на танин
Около 2 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Полученное извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья/препарата не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 25,0 мл полученного водного извлечения помещают в коническую колбу вместимостью 1000 мл, прибавляют 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании калия перманганата раствором 0,02 М до золотисто-желтого окрашивания.
Параллельно проводят контрольный опыт: в коническую колбу вместимостью 1000 мл помещают 525 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании калия перманганата раствором 0,02 М до золотисто-желтого окрашивания.
1 мл калия перманганата раствора 0,02 М соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин.
(V – V 1 ) · 0,004157 · 250 · 100 · 100
X = ————————————————— ,
a · 25 · (100 – W )
V – объем калия перманганата раствора 0,02 М, израсходованного на титрование водного извлечения, мл;
V 1 — объем калия перманганата раствора 0,02 М, израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл;
0,004157 – количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл калия перманганата раствора 0,02 М (в пересчете на танин), г;
a – навеска сырья или лекарственного растительного препарата, г;
W – влажность лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, %;
250 – общий объем водного извлечения, мл;
25 – объем водного извлечения, взятого для титрования, мл.
Примечание. Приготовление раствора индигосульфокислоты. 1 г индигокармина растворяют в 25 мл серной кислоты концентрированной, затем прибавляют дополнительно 25 мл серной кислоты концентрированной и разбавляют водой до 1000 мл, осторожно вливая полученный раствор в воду, в мерной колбе вместимостью 1000 мл, перемешивают.
Метод 2. Определение суммы дубильных веществ в пересчете на пирогаллол
Около 0,5 — 1,0 г (точную навеску или иную, указанную в фармакопейной статье или нормативной документации) измельченного лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 150 мл воды и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Полученное водное извлечение в колбе охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попали в колбу, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр диаметром около 125 мм, отбрасывая первые 50 мл фильтрата.
Определение проводят в защищенном от света месте.
Определение суммы дубильных веществ . 5,0 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл фосфорномолибденововольфрамового реактива, 10 мл воды и доводят объем раствора до метки натрия карбоната раствором 10,6 % (испытуемый раствор). Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора (А 1) на спектрофотометре при длине волны 760 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду.
Определение суммы дубильных веществ, не адсорбируемых кожным порошком. К 10,0 мл фильтрата прибавляют 0,1 г кожного порошка, перемешивают полученную смесь в течение 60 мин и фильтруют через бумажный фильтр. 5,0 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл фосфорномолибденововольфрамового реактива, 10 мл воды, объем раствора доводят до метки натрия карбоната раствором 10,6 % и перемешивают (испытуемый раствор). Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора (А 2) на спектрофотометре при длине волны 760 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду.
Параллельно измеряют оптическую плотность стандартного раствора.
2,0 мл раствора СО пирогаллола помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл фосфорномолибденововольфрамового реактива, 10 мл воды, доводят объем раствора до метки натрия карбоната раствором 10,6 % и перемешивают (стандартный раствор). Через 30 мин измеряют оптическую плотность стандартного раствора (А 3) на спектрофотометре при длине волны 760 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду.
А 1 – оптическая плотность испытуемого раствора при определении суммы дубильных веществ;
А 2 – оптическая плотность испытуемого раствора при определении суммы дубильных веществ, не адсорбируемых кожным порошком, в пересчете на пирогаллол;
А 3 — оптическая плотность стандартного раствора;
a — навеска лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, г;
a 0 — навеска СО пирогаллола, г;
W – влажность лекарственного растительного сырья или лекарственного растительного препарата, %.
Примечание . Приготовление раствора СО пирогаллола . 0,05 г (точная навеска) СО пирогаллола помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. 5,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
